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小鼠補體(C)ELISA試劑盒說明書
本試劑僅供研究使用 目的:本試劑盒用于測定小鼠血清,血漿及相關液體樣本中補體(C)含量。提供免費代檢測服務。
實驗原理:
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠補體(C)水平。用純化的小鼠補體(C)
抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入補體 (C),再與 HRP 標
記的補體 (C)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB
顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深
淺和樣品中的補體 (C)呈正相關。用酶標儀在 450nm波長下測定吸光度(OD 值),通過
標準曲線計算樣品中小鼠補體 (C)濃度。
試劑盒組成:
試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存
說明書 1 份 1份
封板膜 2片(48) 2片(96)
密封袋 1 個 1個
酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
標準品:45μg/ml 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存
標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存
酶標試劑 3ml×1 瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
樣品稀釋液 3ml×1 瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
顯色劑 A 液 3ml×1 瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
顯色劑 B 液 3ml×1 瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
濃縮洗滌液 (20ml×20倍)×1瓶 (20ml×30倍)×1瓶 2-8℃保存
樣本處理及要求:
1. 血清:室溫血液自然凝固 10-20 分鐘,離心 20分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上
清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應再次離心。
2. 血漿:應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合 10-20 分鐘后,離心
20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次
離心。
3. 尿液:用無菌管收集,離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清,保存過程
中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心 20分鐘左右(2000-3000 轉/
分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用 PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞
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濃度達到 100萬/ml 左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分
鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的 PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS(PH7.4),用手工或勻漿器
將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待
檢測,其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上
進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含 NaN3的樣品,因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
操作步驟
1. 標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔 10孔,在*、第二孔中分別加標
準品 100μl,然后在*、第二孔中加標準品稀釋液 50μl,混勻;然后從*孔、第二
孔中各取 100μl 分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液 50μl,
混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉,再各取 50μl 分別加到第五、第六孔
中,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各
取 50μl 分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50μl,混
勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準
品稀釋液 50μl,混勻后從第九第十孔中各取 50μl 棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為 50μl,
濃度分別為 30μg/ml,20μg/ml ,10μg/ml,5μg/ml, 2.5μg/ml)。
2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣
品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl,然后再加待測樣品 10μl(樣
品zui終稀釋度為 5 倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混
勻。
3. 溫育:用封板膜封板后置 37℃溫育 30分鐘。
4. 配液:將 20倍濃縮洗滌液用蒸餾水 20 倍稀釋后備用。
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30 秒后棄去,如此
重復 5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶標試劑 50μl,空白孔除外。
7. 溫育:操作同 3。
8. 洗滌:操作同 5。
9. 顯色:每孔先加入顯色劑 A50μl,再加入顯色劑 B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色
15分鐘.
10. 終止:每孔加終止液 50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
11. 測定:以空白空調零,450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。 測定應在加終止
液后 15分鐘以內進行。
注意事項:
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未
用完,板條應裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
3.各步加樣均應使用加樣器,并經(jīng)常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在 5 分鐘內,如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
4.請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本 OD 值
大于標準品孔*孔的 OD 值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
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5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物請避光保存。
7.嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9.本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。
計算:
以標準物的濃度為橫坐標,OD 值為縱坐標,
在坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的 OD
值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋
倍數(shù);或用標準物的濃度與 OD 值計算出標
準曲線的直線回歸方程式,將樣品的 OD 值
代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋
倍數(shù),即為樣品的實際濃度。
試劑盒性能:
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù) R 值為 0.990以上。
2.批內與批見應分別小于 9%和 11%
保存條件及有效期:
1.試劑盒保存:;2-8℃。
2.有效期:6 個月