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ELISA原理
實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)要點(diǎn):
酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,簡稱ELISA)與免疫酶測定等名稱所指的內(nèi)容是不相同的,ELISA的內(nèi)容專指固相吸附技術(shù)和免疫酶標(biāo)抗體(或抗原)技術(shù)相結(jié)合的一種方法,它是將抗原或抗體包被在固相支持物(或稱載體上),然后再進(jìn)行免疫反應(yīng),形成酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物,反應(yīng)完畢,借助底物顯示特異結(jié)合的標(biāo)記抗體(或抗原)上的酶活性,用酶與底物反應(yīng)后生成的有色產(chǎn)物進(jìn)行光密度測定,達(dá)到抗原或抗體定量的目的。
在應(yīng)用ELISA時(shí),首先要清楚下面內(nèi)容:1,是檢測抗體還是抗原?2,檢測的結(jié)果是定性還是定量?3,是否需要檢測特異抗體的類型?4,所用抗體/單克隆抗體的親和力怎樣?
(1)檢測抗原 zui常用于檢測抗原的方法是非競爭性的雙抗體夾心法,其次是競爭法。但競爭法在具體實(shí)驗(yàn)中有些困難,特別是檢測微生物的抗原,因?yàn)樾枰獦?biāo)記抗原,這對于某些抗原是很難做到的,甚至是不可能的。另外在競爭法中,酶標(biāo)記的抗原與標(biāo)本直接混合在一起,許多標(biāo)本中含有酶抑制劑或蛋白A樣物質(zhì),可影響ELISA的結(jié)果。
(2)檢測抗體 檢測抗體種類常用的方法是檢測抗體種類的捕獲法,這個方法常用于檢測特異性IgG、IgA和IgM.。這個方法的*步是捕獲所需要檢測的一個種類的抗體,接下來是檢測捕獲的抗體是否是特異性抗原的抗體。間接ELISA在檢測IgG時(shí)比較簡單,但不適用于檢測其他種類的抗體,因?yàn)檠逯腥绻刑禺?/span>IgG存在將與IgM或IgA等競爭結(jié)合抗原。
競爭法檢測抗體有兩種方法:一種是將標(biāo)記的抗體和標(biāo)本同時(shí)加入反應(yīng)孔內(nèi),但標(biāo)記的抗體和標(biāo)本中的抗體必須是結(jié)合抗原的不同決定簇;另一種是先加標(biāo)本,沖洗后再加標(biāo)記的抗體。競爭法檢測抗體比間接法容易判斷結(jié)果,并且比較敏感和特異。不論選擇哪種方法,ELISA都包括6個步驟:1,抗原或抗體吸附于固相;2.加標(biāo)本和試劑;3,孵育和沖洗;4,加酶標(biāo)抗原或抗體;5,加適當(dāng)?shù)牡孜铮?/span>6,檢測和分析結(jié)果。
雖然ELISA法在理論上十分簡單,但每一步都有要注意的事項(xiàng)。不論是新設(shè)計(jì)的ELISA還是沿用其他ELISA方法都有以下幾方面技術(shù)要點(diǎn):固相載體的選擇和試劑的制備,反應(yīng)條件和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。酶標(biāo)記抗原競爭法利用混合的未標(biāo)記抗原和酶標(biāo)記抗原相互競爭抗體上的結(jié)合點(diǎn),從而進(jìn)行抗原的定量。未標(biāo)記抗原的量越大,則酶標(biāo)記抗原和抗體的結(jié)合就越受到抑制。但是競爭法在實(shí)驗(yàn)時(shí)比較復(fù)雜,有時(shí)在抗原混合液與相應(yīng)抗體孵育后,在測定游離抗原與抗體相結(jié)合抗原的活性以前,要先進(jìn)行鹽析或有機(jī)溶劑沉淀或第二抗體沉淀等方法把兩種不同存在形態(tài)的抗原分開。并且在加入底物后,容易產(chǎn)生血清色的物質(zhì)。因此,每次測定時(shí)都需做空白對照。由于這些缺點(diǎn),酶標(biāo)記抗原競爭法使用不多。
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