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一步法快速WB(HRP)試劑盒(兔)說(shuō)明書(shū)
One Step Western Kit HRP (Rabbit)
目錄號(hào):K2029
保存條件:2-8℃保存,避免冷凍。
組分說(shuō)明
Cat. No. K2029 K2029A K2029B
Kit Size 10 2 50
封閉液 125 ml 3 0 m l 500 ml
抗體反應(yīng)液 HRP(兔) 1 ml 2 0 0 μ l 5×1 ml
抗體稀釋液 125 ml 3 0 m l 500 ml
漂洗液(10×) 125 ml 3 0m l 500 ml
本產(chǎn)品僅供科研使用,請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途產(chǎn)品簡(jiǎn)介
一步法快速WB試劑盒(兔)是上海研謹(jǐn)生物xin推出的Western Blot檢測(cè)試劑盒,能夠在1小時(shí)左右得到高質(zhì)量的Western Blot結(jié)果,且操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、背景低、不需再加入二抗、系統(tǒng)穩(wěn)定性強(qiáng)。常規(guī)的Western Blot間接法檢測(cè)過(guò)程(封閉、一抗結(jié)合和二抗結(jié)合)需要較長(zhǎng)的時(shí)間,實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜且需要多步條件優(yōu)化。膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到載體膜上后,使用試劑盒中的封閉液孵育5 min,再用抗體反應(yīng)液處理后的一抗孵育載體膜,經(jīng)洗滌三次(每次5 min)后,即可進(jìn)行發(fā)光或顯色檢測(cè)。本試劑盒針對(duì)目的蛋白一抗為兔來(lái)源的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)使用。
注意事項(xiàng)
1. 客戶(hù)需自己準(zhǔn)備兔來(lái)源的一抗。
2. 使用封閉液、抗體稀釋液(兔)、漂洗液之前請(qǐng)充分混勻。
3. 漂洗液如在2-8℃保存時(shí)出現(xiàn)沉淀,請(qǐng)恢復(fù)到室溫,把沉淀溶解后正常使用,1×漂
洗液可在室溫保存一個(gè)月。
4. 建議轉(zhuǎn)膜完成后用麗春紅等試劑染色,并把膜上多余部分剪去以增加試劑的使用效
率。
5. 一抗和抗體反應(yīng)液HRP(兔)需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定jia的稀釋用量。
6. 抗體反應(yīng)液HRP(兔)、抗體稀釋液和抗體用量可根據(jù)膜的大小按比例放大或減少。
7. 加入一抗的抗體稀釋液可以回收重復(fù)使用一次。特異性及親和力低的抗體不建議重
復(fù)使用?;厥蘸罂贵w如在1-2天內(nèi)使用放置在2-8℃,長(zhǎng)期保存請(qǐng)?jiān)?20℃凍存,避
免多次反復(fù)凍融。
8. 如果存在較高背景的情況,請(qǐng)調(diào)整抗體的用量,并增加洗膜次數(shù)。
9. 試劑盒內(nèi)所有試劑請(qǐng)于2-8℃保存,避免凍融。
操作步驟
本產(chǎn)品適用于轉(zhuǎn)膜完成后的封閉及抗體孵育步驟,以5 cm×8 cm 膜為例:
1.漂洗液準(zhǔn)備:取10 ml 10×漂洗液用蒸餾水稀釋至100 ml待用。每次洗膜用8-10 ml。
2.轉(zhuǎn)膜完成后,將膜浸沒(méi)到10 ml封閉液中,室溫封閉5分鐘。
3.倒掉封閉液,加入8-10 ml 1×漂洗液,于搖床上用較大速度漂洗1分鐘。
4.洗膜的同時(shí)可準(zhǔn)備抗體孵育液:取抗體反應(yīng)液HRP(兔)100 μl到EP管中,加入兔
源一抗3-10 μg,槍頭吸打至充分混勻,室溫孵育5分鐘。
5.將混勻的抗體與反應(yīng)液HRP(兔)混合液加入到10 ml 抗體稀釋液中,充分混勻。
注意:1)一抗的用量也可根據(jù)抗體的稀釋度來(lái)進(jìn)行調(diào)整。以抗體的終稀釋度1:1000為例,取100 µl抗體反應(yīng)液HRP(兔)到EP管中,加入10 µl一抗,加入到10 ml 抗體稀釋液中,充分混勻,室溫孵育5分鐘。
2)如果膜面積較小,可按比例減少抗體、反應(yīng)液及稀釋液的用量。
6.步驟3中,洗膜完成后,倒掉漂洗液,將混合一抗、反應(yīng)液及稀釋液的抗體孵育液
加到膜上(確保孵育液*浸沒(méi)膜表面),在搖床上以60rpm左右的速度室溫孵育40分鐘。
7.棄去(回收)抗體稀釋液,用1×漂洗液漂洗3-5次,每次3分鐘。
8.進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。建議采用ECL試劑盒(YJ0049)進(jìn)行檢測(cè)。
常見(jiàn)問(wèn)題解答
問(wèn) 題:信號(hào)太弱或者看不到條帶
可 能 原因:
a蛋白上樣量太少
b蛋白轉(zhuǎn)膜效率太低
c一抗親和力較低
解決方案:
a進(jìn)行SDS-PAGE電泳時(shí)加大上樣量。
b優(yōu)化轉(zhuǎn)膜時(shí)間或者電流,確保轉(zhuǎn)膜時(shí)膜與膠之間沒(méi)有氣泡。
c增加膜在溶液(含有mixture 1的WB-2)中的孵育時(shí)間。
增加抗體濃度可以增加信號(hào)。
d 對(duì)于低親和力抗體來(lái)說(shuō),減少洗膜時(shí)間可以增加信號(hào)。
由每次10min,減少到每次5min可以增加信號(hào)。
問(wèn) 題:背景偏高
可 能 原因:
a一抗使用過(guò)量
b一抗有非特異性結(jié)合或者與封閉試劑有交叉反應(yīng)
c洗膜時(shí)間太短
d曝光顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
e容器或者試劑被污染
解決方案:
A減少一抗的使用量,相應(yīng)的減少WB-1用量。
B使用pretreat A-b(M01052)。 客戶(hù)還可以使用Quick Block Optimization kit 來(lái)找到j(luò)ia的封閉試劑。
C增加洗滌的步驟可以進(jìn)一步的降低背景。
D減少曝光時(shí)間。如果信號(hào)和背景都高,可以等待一段時(shí)間,等背景信號(hào)減弱后,再進(jìn)行曝 光。
e每次洗滌的時(shí)候使用清潔的容器。帶手套,使用清潔的鑷子處理膜。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):
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