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一步法快速WB(HRP)試劑盒(鼠)說明書
更新時(shí)間:2021-01-12 點(diǎn)擊量:2179

一步法快速WB(HRP)試劑盒(鼠)說明書

 

One Step Western Kit HRP(Mouse)

  

目錄號:  K2030     

保   存:  2 - 8  ℃,避免冷凍

 

組分說明

 

Cat. No.           K2030          K2030A        K2030B

Kit Size              10           2             50

封閉液               125 ml        30 ml         500 ml

抗體反應(yīng)液            HRP(鼠)     1 ml         200  μl      5×1 ml

抗體稀釋液            125 ml        30 ml        500 ml

漂洗液(10×)        125 ml        30 ml         500 ml

 

產(chǎn)品簡介

 

      一步法快速WB 試劑盒(鼠)是上海研謹(jǐn)生物xin推出的Western  Blot 檢測試劑盒,能夠在1 小時(shí)左右得到高質(zhì)量的 Western Blot 結(jié)果,且操作簡便、檢測靈敏度高、背景低、不需再加入二抗、系統(tǒng)穩(wěn)定性強(qiáng)。常規(guī)的Western Blot 間接 法檢測過程(封閉、一抗結(jié)合和二抗結(jié)合)需要較長的時(shí)間,實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜且需要多步條件優(yōu)化。膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到載體膜上后,使用試劑盒中的封閉液孵育5 min,再用抗體反應(yīng)液處理后的一抗孵育載體膜,經(jīng)洗滌三次(每次5  分鐘)后,即可進(jìn)行發(fā)光或顯色檢測。本試劑盒針對目的蛋白一抗為鼠來源的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)使用。

 

注意事項(xiàng)

 1.  客戶自己準(zhǔn)備鼠來源的一抗。

 2.  使用封閉液、抗體稀釋液(鼠)、漂洗液之前請充分混勻。

 3.  漂洗液如在2-8  ℃保存時(shí)出現(xiàn)沉淀,請恢復(fù)到室溫,把沉淀溶解后正常使用,1×漂洗液可在室溫保存一個(gè)月。

 4.  建議轉(zhuǎn)膜完成后用麗春紅等試劑染色,并把膜上多余部分剪去以增加試劑的使用效率。

 5.  一抗和抗體反應(yīng)液HRP(鼠)需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定jia的稀釋用量。

 6.  抗體反應(yīng)液HRP(鼠)、抗體稀釋液和抗體用量可根據(jù)膜的大小按比例放大或減少。

 7.  加入一抗的抗體稀釋液可以回收重復(fù)使用一次。特異性及親和力不好的抗體建議不重復(fù)回收使用?;厥蘸罂贵w如在1-2天內(nèi)使用放置在2-8  ℃,長期保存請?jiān)?20℃凍存,避免多次反復(fù)凍融。

 8.  如果存在較高背景的情況,請調(diào)整抗體的用量,并增加洗膜次數(shù)。

 9.  試劑盒內(nèi)所有試劑請于2-8  ℃保存,避免凍融。

 

 操作步驟

 

 本產(chǎn)品適用于轉(zhuǎn)膜完成后的封閉及抗體孵育步驟,以5 cm×8 cm  膜為例:

 1.  漂洗液準(zhǔn)備:取10 ml 10×漂洗液用蒸餾水稀釋至100 ml,待用。每次洗膜用8-10 ml。

 2.  轉(zhuǎn)膜完成后,將膜浸沒到10 ml封閉液中,室溫封閉5分鐘。

 3.  倒掉封閉液,加入8-10 ml 1×漂洗液,于搖床上用較大速度漂洗1分鐘。

  4.  洗膜的同時(shí)可準(zhǔn)備抗體孵育液:取抗體反應(yīng)液HRP(鼠)100μl到EP管中,加入鼠源一抗3-10μg,槍頭吸打至充分混勻,室溫孵育5分鐘。

  5.  將混勻的抗體與反應(yīng)液HRP(鼠)混合液加入到10 ml  抗體稀釋液中,充分混勻。

 

   注意:1)一抗的用量也可根據(jù)抗體的稀釋度來進(jìn)行調(diào)整。以抗體的終稀釋度1:1000為例,取100μl抗體反應(yīng)液HRP(鼠)到EP管中,加入10μl一抗,加入到10 ml  抗體稀釋液中,充分混勻,室溫孵育5分鐘。

2)如果膜面積較小,可按比例減少抗體、反應(yīng)液及稀釋液的用量。

6.  步驟3中,洗膜完成后,倒掉漂洗液,將一抗、反應(yīng)液及稀釋液混合而成的抗體孵育液加到膜上(確保孵育液*浸沒膜表面),在搖床上以適當(dāng)速度室溫孵育40分鐘。

  7.  棄去(回收)抗體稀釋液,用1×漂洗液漂洗3-5次,每次3分鐘。

  8.  進(jìn)行后續(xù)檢測。建議采用ECL或者沉淀型TMB法進(jìn)行檢測。

應(yīng)用實(shí)例

 

A:  普通WB對照:beta-actin鼠單抗(YJ0096)5ug室溫孵育40min,洗膜后二抗羊抗鼠-HRP

 

(YJ0102)1:10000稀釋,室溫40min,ECL(YJ0049)曝光

 

B:  一步法WB: beta-actin鼠單抗(YJ0096)5ug 室溫孵育40min ,ECL(YJ0049)曝光

 

 

實(shí)例一  抗原為         293T 細(xì)胞全裂解液(YJ0065) 

 

 

 

 C:普通 WB 對照:GST 鼠單抗(K0084)2.5ug 室溫孵育40min,洗膜后二抗羊抗鼠-HRP

 

(K0102)1:10000 稀釋,室溫40min,ECL(K0049)曝光。

 

D:一步法WB:  GST 鼠單抗(K0084)2.5ug  室溫孵育40min ,ECL(K0049)曝光。

 

實(shí)例二  抗原為         E.coli 多標(biāo)簽蛋白裂解液(K2016) 

常見問題及解決辦法  

 

問題:信號太弱或者看不到條帶                                                      

可能原因:

a蛋白上樣量太少

b蛋白轉(zhuǎn)膜效率太低

c一抗親和力較低

解決方案:  

A 進(jìn)行SDS-PAGE電泳時(shí)加大上樣量。

B 優(yōu)化轉(zhuǎn)膜時(shí)間或者電流,確保轉(zhuǎn)膜時(shí)膜與膠之間沒有氣泡。  

C 增加膜在溶液(含有mixture 1的WB-2)中的孵育時(shí)間。 增加抗體濃度可

   以增加信號。

D 對于低親和力抗體來說,減少洗膜時(shí)間可以增加信號。由每次10min,減少到每次5min     可以增加信號。  

 

問題:背景偏高

可能原因:

a 一抗使用過量                      

b一抗有非特異性結(jié)合或者與封閉試劑有交叉反應(yīng)     

c洗膜時(shí)間太短

d曝光顯影時(shí)間過長

e容器或者試劑被污染

解決方案:

A  減少一抗的使用量,相應(yīng)的減少WB-1用量。

B  使用 pretreat A-b(M01052)。客戶還可以使用 Quick Block Optimization kit 來找到j(luò)ia的封閉試劑。

C  增加洗滌的步驟可以進(jìn)一步的降低背景。

D  減少曝光時(shí)間。如果信號和背景都高,可以等待一段時(shí)間,等背景信號減弱后,再進(jìn)行  曝光。

E  每次洗滌的時(shí)候使用清潔的容器。帶手套,使用清潔的鑷子處理膜。

 

 

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

ELISA試劑盒免費(fèi)代檢測

CCK8檢測

HE染色

蛋白相互作用分析

Western Blot

免疫組化IHC染色

熒光定量PCR

動物模型服務(wù)

流式細(xì)胞檢測

免疫熒光染色

激光共聚焦

DNA甲基化實(shí)驗(yàn)

石蠟/冰凍切片

透射電鏡服務(wù)

掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

蛋白雙向(2-D)

動物實(shí)驗(yàn)

免疫共沉淀

原位雜交(FIsh

蛋白質(zhì)純化

分子克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建服務(wù)

組蛋白甲基化磷酸化乙?;?/a>

 

蛋白雙向2D-WB

 

藥理毒理動物實(shí)驗(yàn)

 

番紅O固綠染色

明膠酶譜MMP

酶活性檢測

動物造模/模型實(shí)驗(yàn)服務(wù)

滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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