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GoldStar Best DNA Polymerase說明書
(5×GoldStar Best PCR Buffer With Mg )2+
目錄號:K0654
保存條件:-20℃保存。
組分說明
Cat. No. K0654 K0654A K0654C
Kit Size 250 U 500 U 6×500 U
GoldStar Best DNA Polymerase, 5 U/μl 50 μl 100 μl 6×100 μl
5×GoldStar Best PCR Buffer 1 ml 2×1 ml 3×5 ml
注意:本產品的5×GoldStar Best PCR Buffer中含有7.5mM鎂離子。
產品簡介
該產品是經(jīng)過特殊處理的熱啟動高保真聚合酶。該聚合酶具有 5′-3′DNA聚合酶活
性,5′-3′核酸外切酶活性和3′-5′核酸外切酶活性,在普通PCR條件下,與GoldStar Taq
DNA Polymerase相比,具有擴增效率高、錯配率低的優(yōu)良性能?;瘜W修飾使該酶在常
溫下沒有聚合酶活性,有效避免在常溫條件下由引物和模板非特異性結合或引物二聚
體而產生的非特異性擴增,酶的激活須在 95℃下孵育10分鐘,該條件可以整合入已有
的PCR熱循環(huán)程序。優(yōu)化的緩沖體系使酶的作用發(fā)揮最大功效,實現(xiàn)對目的片段的高
保真、高特異性、高擴增效率、高靈敏度擴增。使用本制品擴增得到的 PCR產物的3′
端附有一個“A"堿基,因此可直接用于T/A克隆。本產品應用于常規(guī)的PCR、RT-PCR和
多重PCR,特別適用于對特異性、保真性和擴增效率均有較高要求的PCR。
活性定義
用活性化的大馬哈魚精ziDNA作為模板/引物,在74℃,30分鐘內,將10 nmol脫
氧核苷酸摻入到酸性不溶物質所需的酶量定義為1個活性單位(U)。
質量控制
經(jīng)過多次柱純化, SDS-PAGE檢測其純度大于99%;經(jīng)檢測無外源核酸酶活性;
PCR方法檢測無宿主殘余DNA;能有效地擴增人基因組中的單拷貝基因;室溫存放一
個月,無明顯活性改變。
本產品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途
使用方法
以下舉例為常規(guī)PCR反應體系和反應條件,實際操作中應根據(jù)模板、引物結構和目的
片段大小不同進行相應的改進和優(yōu)化。
1. PCR反應體系
試劑 50 μl反應體系 終濃度
5×GoldStar Best Taq PCR Buffer 10 μl 1×
dNTP Mix,2.5 mM each 4 μl 200 μM each
Forward Primer,10 μM 2 μl 0.4 μM
Reverse Primer,10 μM 2 μl 0.4 μM
Template DNA <1 μg <1 μg/reaction
GoldStar Best Taq DNA Polymerase,5 U/μl 0.5 μl
RNase-Free Water up to 50 μl
注意:1)引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下,可提高引物的濃度;發(fā)生非特異性反應時,可降低引物濃度,由此優(yōu)化反應體系。
2)鎂離子濃度請以終濃度1.5-3 mM作為設定范圍的參考。本產品的5×GoldStar Best Taq PCR Buffer中已含有7.5 mM鎂離子,可根據(jù)不同引物對和模板調節(jié)鎂離子濃度,由此優(yōu)化反應體系。
2. PCR反應條件
步驟 溫度 時間
預變性 95℃ 10 min
變性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 30-40個循環(huán)
延伸 72℃ 60 s
終延伸 72℃ 5 min
注意:1)一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃,無法得到理想的擴增效率時,適當降低退火溫度;發(fā)生非特異性反應時,提高退火溫度,由此優(yōu)化反應條件。
2)延伸時間應根據(jù)所擴增片段大小設定,本產品中所包含的GoldStar Best DNA Polymerase的擴增效率為1 kb/min。
3)可根據(jù)擴增產物的下游應用設定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少,擴增量不足;如果循環(huán)次數(shù)太多,錯配機率會增加,非特異性背景嚴重。所以在保證產物得率的前提下應盡量減少循環(huán)次數(shù)。
4)本產品須在預變性95℃,10 min條件下實現(xiàn)酶的活化。
3.結果檢測:反應結束后取5 µl反應產物,加入適量上樣緩沖液后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
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