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TB基因分型試劑盒HV-3說(shuō)明書(shū)

TB Typing Kit HV-3

TB基因分型試劑盒HV-3說(shuō)明書(shū)

目錄號(hào)：K2571

保存：2-8℃  1 個(gè)月，-20℃保存一年

組分說(shuō)明

應(yīng)用                      Cat. No.          YJ2571-20       K2571-50

                           Kit Size           20             50

                           VNTR3820        400 μl         1 ml

高分辨3位點(diǎn)VNTR檢測(cè)    VNTR4120         400 μl         1 ml

                          VNTR3232          400 μl        1 ml

DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) I          MarkerⅠ           120 μl       300μl

DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) II         MarkerⅡ            100 μl      250μl

其它相關(guān)產(chǎn)品K2570 TB基因分型試劑盒 VNTR-9

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

    本試劑盒是以分子流行病學(xué)最新研究進(jìn)展1）為基礎(chǔ)，經(jīng)工藝優(yōu)化后形成的人型結(jié)核分枝桿菌基因分型產(chǎn)品。本產(chǎn)品利用結(jié)核分枝桿菌基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable-number tandem repeats, VNTR）多態(tài)性進(jìn)行基因型分型區(qū)分臨                                                床菌株，是研究結(jié)核分枝桿菌分子流行病學(xué)和監(jiān)測(cè)結(jié)核病傳播狀況的有力工具。與現(xiàn)有其它基于VNTR原理的結(jié)核分枝桿菌VNTR分型系統(tǒng)相比，這一分型系統(tǒng)對(duì)中國(guó)流行的菌株具有更強(qiáng)的分辨能力1，2，3），因此特別適合于中國(guó)用戶的需求。

    通過(guò)對(duì)各PCR反應(yīng)引物序列和預(yù)混反應(yīng)液成份進(jìn)行精心優(yōu)化，使得本產(chǎn)品具有很強(qiáng)的抗干擾力。與用戶自配試劑相比，本產(chǎn)品顯著提升了特異條帶信號(hào)強(qiáng)度，降低了使用粗制模板（煮沸菌液）時(shí)非特異條帶的出現(xiàn)率，使實(shí)驗(yàn)操作更加簡(jiǎn)便、快捷的同時(shí)，提高了檢測(cè)成功率。本產(chǎn)品的預(yù)混反應(yīng)液化學(xué)穩(wěn)定性良好，能有效抵抗反復(fù)凍融（10次）和較長(zhǎng)時(shí)間（一周）的室溫環(huán)境，更好地適應(yīng)了用戶檢測(cè)工作中的靈活性需求。

     本試劑盒是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9（貨號(hào) YJ2570）的配套產(chǎn)品。對(duì) VNTR-9 試劑盒鑒定為成簇或相同菌株的樣本，如有必要，可使用本產(chǎn)品做更精細(xì)的進(jìn)一步分型鑒定。本產(chǎn)品中的 3 個(gè)高分辨率檢測(cè)位點(diǎn) VNTR3820，VNTR4120和VNTR3232 與 VNTR-9 中的 9 個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)結(jié)合使用可將檢測(cè)的分辨率指數(shù)（Hunter-Gaston index，HGI)提升至 0.993                                                                                                                1）

參考文獻(xiàn)

1） Luo T et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme for Mycobacterium

    tuberculosis in China. PLoS One. 2014 Feb 25;9(2)

2） Sun G et al. Discriminatory potential of a novel set of Variable Number of Tandem Repeats for genotyping

    Mycobacterium marinum. Vet Microbiol. 2011 Aug 26;152(1-2)

3） Zhang L et al. Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype

    strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China. FEMS Microbiol Lett. 2008 May;282(1):22-31.

注意事項(xiàng)

1.  本產(chǎn)品是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9（貨號(hào) YJ2570）的配套產(chǎn)品。待測(cè)菌株應(yīng)先經(jīng)過(guò) VNTR-9 分型檢測(cè)，再使用  本產(chǎn)品檢測(cè)。且本產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)與 VNTR-9 的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合分析。

2.  為避免污染，建議制備生物時(shí)與配制 PCR Mix 在不同的地點(diǎn)內(nèi)進(jìn)行，并使用不同的移液器。

3.  在樣本 DNA 的收集，抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)注意作好標(biāo)記，同時(shí)防止不同樣本間發(fā)生交叉污染。

4.  常用試劑和耗材在實(shí)驗(yàn)前需高壓滅菌。

5.  每管 PCR Mix 中均含有不同的引物，不可混用?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需求一次性分裝為不同的量，避免反復(fù)凍融。

6.  為避免打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)，反應(yīng)液飛濺，開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用 75%酒精或稀酸擦拭桌面。

7.  吸取時(shí)注意不要交叉污染 PCR Mix，建議每次取 Mix 前用 75%酒精擦拭移液器頭 2 次。

8.  實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1×TE  緩沖液（PH=8.0）、0.5×TBE 緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）、普通 PCR 儀、DNA 電泳設(shè)備和凝膠成像儀、0.2 ml PCR 反應(yīng)管、八聯(lián)排或 96 孔 PCR 管、不同規(guī)格的移液器：0.5-10 μl 和 20-200 μl。

操作步驟

1.  DNA 模板制備：

1.1  從固體培養(yǎng)基上刮取少量(1-2 接種環(huán))樣本，重懸于 100 ul TE 中，80°C 滅活 30 分鐘。

1.2  滅活后的菌株拿出 P3 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行如下操作：

     100°C 煮沸 10 分鐘(煮沸時(shí)注意避免 EP 管蓋子爆開(kāi)，避免讓水進(jìn)入管中)，立即置于冰上 2 分鐘，12,000 rpm (~13,400×g)離心 10 分鐘，取上清置于另一無(wú)菌 EP 管中，做上標(biāo)記，-20°C 保存。

2 .  檢測(cè)程序：

2.1  取出 TB 基因分型試劑盒 HV-3，待液體平衡到室溫后，輕微搖晃 3-4 次混勻，然后 12,000 rpm (~13,400×g)離心5秒，使蓋上的液體回落到管內(nèi)。                                                                                                    2.2  三位點(diǎn) VNTR 分型：對(duì)于 12 位點(diǎn)結(jié)果相同的菌株需進(jìn)一步進(jìn)行 VNTR 分型，即增加以下 4 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行比較。

1）PCR 擴(kuò)增：反應(yīng)體系為 20 μl。

   在每個(gè) PCR 管里分別加入 19 μl VNTR3820、VNTR4120、VNTR3232 的  PCR Mix，加入 1 μl DNA 模板，混勻。

2）擴(kuò)增條件：

a .  VNTR3820：

                        步驟           溫度              時(shí)間

                         預(yù)變性         95℃           10 min

                         變性            94℃             30 s

                        退火             58℃         30 s      30 個(gè)循環(huán)

                        延伸             72℃         90 s

                        終延伸           72℃         7 min

b.  VNTR3232、VNTR4120：

                        步驟             溫度            時(shí)間

                      預(yù)變性            95℃          10 min

                      變性              94℃            30 s

                     退火               64℃            30 s    30 個(gè)循環(huán)

                     延伸               72℃            90 s

                    終延伸             72℃            7 min

3）制膠、電泳：

   a：注意事項(xiàng)：  

   重要！每次實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置陽(yáng)性（H37Rv 菌株 DNA）和陰性對(duì)照（去離子水）。

   關(guān)鍵！本實(shí)驗(yàn)是以瓊脂糖凝膠電泳為基礎(chǔ)來(lái)判讀 VNTR 位點(diǎn)基因型，因此，為了使結(jié)果準(zhǔn)確，在電泳這一步必須要按照統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

   a-1：制膠所用梳子為 18 孔。

   a-2：凝膠左右邊上的兩個(gè)孔由于在電泳過(guò)程中容易使條帶變形，影響結(jié)果判讀，舍棄不用，或者在其中一個(gè)孔點(diǎn)上陰性對(duì)照。剩余 16 孔分為 12 個(gè)樣本，3 個(gè) DNA Marker 和 1 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。點(diǎn)樣順序分別為“1，2，M，3，4，5，

         6，  M，7，8，9，10，M，11，12，H37Rv"，數(shù)字代表樣本，M 代表 DNA Marker。

   a-3：PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第—次電泳并使用 Marker I 時(shí)，凝膠濃度為 1%，電壓為 150V，時(shí)間為 100-120 分鐘。

   a-4：如果擴(kuò)增產(chǎn)物片段過(guò)大（>1000bp），需要再次電泳并使用 Marker II 時(shí)，凝膠濃度為 0.8%，電壓 150V，時(shí)間為150 分鐘。

   b：制膠以及電泳過(guò)程：

   使用 1%的瓊脂糖凝膠對(duì) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。

   配制 1%的瓊脂糖凝膠，12×12 cm 膠盤(pán)制膠，每塊膠為 80 ml。

   b-1：稱(chēng)取 0.8 g 瓊脂糖，加入 80 ml 0.5×TBE，在天平上稱(chēng)重后放入微波爐，高火加熱 2-3 分鐘，使瓊脂糖*溶化，搖勻，觀察為均一透明溶液，無(wú)顆粒，再在天平稱(chēng)量，補(bǔ)入適量的雙蒸水，以保持膠的濃度不受影響。

   b-2：待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時(shí)加入 4 μl 溴化乙錠（10 ug/ml），輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠，將溫?zé)岬哪z澆灌入 12×12 cm 膠盤(pán)。

   b-3：待凝膠*凝結(jié)（室溫下放置 40 分鐘），小心拔出梳子，取出托盤(pán)，放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液，沒(méi)過(guò)膠面 1-2 mm。

   b-4：上樣電泳：每塊膠中加入 12 個(gè)樣本（最邊上的孔不加樣），每個(gè)孔中加入 3-5 μl PCR 產(chǎn)物，同時(shí)每塊膠上加三個(gè) 5 μl DNA MarkerⅠ。電壓 150V，電泳時(shí)間為 100-120 分鐘。本步驟是各位點(diǎn)最終讀數(shù)是否準(zhǔn)確的關(guān)鍵，需要統(tǒng)一按照此標(biāo)準(zhǔn)操作。

   b-5：部分位點(diǎn)在臨床菌株中存在擴(kuò)增產(chǎn)物大于 1000 bp 的情況，對(duì)這些擴(kuò)增產(chǎn)物再利用 0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，同時(shí)加入 DNA Marker II 作為條帶大小對(duì)照，電壓 150V，電泳時(shí)間 150 分鐘。

4）結(jié)果顯示：

MarkerⅠ  

MarkerⅡ

5）結(jié)果分析：

   a.  如果不同菌株的 3 個(gè)高變位點(diǎn)基因型也相同，可確定為成簇菌株；

   b.  如果高變位點(diǎn)讀數(shù)高度相似，即只有 1-2 個(gè)高變位點(diǎn)有差別，需結(jié)合流行病學(xué)數(shù)據(jù)鑒定是否為成簇菌株；

   c.  如果 3 個(gè)高變位點(diǎn)基因型都不一致，鑒定為單一菌株。

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