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新霉素快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物新霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗新霉素抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物新霉s的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物新霉素的含量。

二、試劑盒特性

試劑盒靈敏度：  0.1ppb

孵育溫度： 25℃

孵育時間： 30min～15min

樣本檢測下限

肌肉組織 ···········································  4ppb

蜂 蜜 ···········································  4ppb

牛奶、奶粉···········································  4ppb

交叉反應(yīng)率

新m素 ·········································· 100%

鏈m素 ········································· ﹤0.1%

慶大m素 ······································ ﹤0.1%

雙氫鏈霉s ··································· ﹤0.1%

卡那霉s ······································ ﹤0.1%

妥布霉素 ······································ ﹤0.1%

紫蘇霉素 ······································ ﹤0.1%

樣本回收率

肌肉組織 ····································· 90±30%

雞肝、豬肝 ·································· 70±17%

牛奶、奶粉 ···································· 90±30%

蜂蜜 ··········································· 90±30%

三、試劑盒組成

1 微量測試孔 每條 8 孔，一板 12 條

 標準液×6 瓶 0ppb 0.1ppb

2  0.3ppb 0.9ppb

 （1ml/瓶）  

  2.7ppb 8.1ppb

3 酶標記物 7ml 紅色帽

4 抗體工作液 7ml 藍色帽

5 底物 A 液 7ml 白色帽

6 底物 B 液 7ml 黑色帽

7 終止液 7ml 黃色帽

8 20X 濃縮洗滌液 40ml 白色帽

9 2X 濃縮復(fù)溶液 50ml 透明帽

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、

多道 30～300 µl

試 劑：氫氧*#化鈉、三氯乙S

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理需配制：

配液 1  3%三氯乙S溶液：

稱取3 g 三氯Y酸加去離子水100ml 溶解。配液 2 2%三氯乙S溶液：

稱取2 g 三氯Y酸加去離子水100ml 溶解。

配液 3  2M NaOH 溶液：

稱 8g NaOH 加去離子水定容至 100ml。

配液 4  樣本復(fù)溶液：

將2X 濃縮復(fù)溶液用去離子水按 1：1 稀釋。

u樣本處理：

（a）組織（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚）處理方法

1、稱取 2 g±0.05 g 均質(zhì)后的組織樣本于 50ml 離心管中，加入 8ml 3%三氯乙S，振蕩 5min，室溫

4000r/min 以上離心 10min；

2、取出 2ml 上清液于另一試管中，用 2M NaOH 調(diào) pH 值至 7.0～7.5 之間（大約加入 100µl）。取調(diào) pH 值后的液體用樣本復(fù)溶液 1：4（100µl+400µl 樣本復(fù)溶液）稀釋，混合 30s；3、取 50 µl 用于分析

樣本稀釋倍數(shù):  20 倍

（b）蜂蜜、奶粉、牛奶處理方法

1、稱取 2 g±0.05 g（牛奶取 2ml）樣本于 50ml 離

心管中，加入 8ml 2%三氯乙Yi酸，振蕩 5min，室溫 4000r/min 以上，離心 10min；

2、取出 2ml 上清液于另一試管中，用 2M NaOH 調(diào) pH 值至 8.0 左右（大約加入 100µl）。取調(diào) pH 值后的液體用樣本復(fù)溶液 1：4（100µl+400µl樣本復(fù)溶液）稀釋，混合 30s；3、取 50µl 用于分析樣本稀釋倍數(shù):  20 倍

六、酶標免疫分析程序:

測定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。

3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

操作步驟：

1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于 2-8℃。

3、配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、加標準品/樣品 50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物 50µl/孔，然后再加入抗體工作液 50µl/ 孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應(yīng) 30min。

6、將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色 15min。

8、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含新霉素量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3，樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是：

0ppb 為 2.243； 0.1ppb 為 1.816；0.3ppb 為 1.415； 0.9ppb 為 0.74；2.7ppb 為 0.313；8.1ppb 為 0.155。

則樣本 1 的濃度范圍是 2.7ppb～8.1ppb；樣本 2 的濃度范圍是 0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中新霉素實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0 標準）的吸光度值，再乘以 100%，即  提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正

  常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

百分吸光率（%）＝ B

  ×100%

 B0

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以新霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù) 即為樣本中新霉素實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

八、 注意事項

1、室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～

25℃）會導(dǎo)致所有標準的 OD 值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為 25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1、儲藏條件：試劑盒于 2～8℃保存，不要冷凍。

2、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

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