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TRIzon總RNA提取試劑說明書
TRIzon Reagent
目錄號:K0580
保存條件:2-8℃避光保存。
組分說明
Cat. No. K0580 K0580A
TRIzon Reagent 20 ml 100 ml
本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途
產(chǎn)品簡介
TRIzon是廣譜型總RNA提取試劑。實驗操作快速方便,顏色鮮明,便于分層。本
試劑適用范圍廣泛,可以從動物組織、植物材料、各種微生物及培養(yǎng)細(xì)胞等樣品中提
取總RNA。樣品在TRIzon中被充分裂解的同時能夠最大限度地保證 RNA的完整性。在
加入氯仿離心后,溶液會分成三層:上層無色水相、中間層和下層紅色有機(jī)相,RNA
分布在上清層中。收集上清層后,經(jīng)異丙醇沉淀便可以回收得到總RNA。提取的總
RNA完整性好,無蛋白和 DNA污染,可用于各種分子生物學(xué)常規(guī)實驗,如 RT-PCR、
Real-time RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、體外翻譯等。
實驗前準(zhǔn)備及重要注意事項
1.預(yù)防RNase污染,應(yīng)注意以下幾方面:
1)使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。
2)玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時,塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸
泡10分鐘,用水*沖洗后高壓滅菌。
3)配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。
4)操作人員戴一次性口罩和手套,實驗過程中要勤換手套。
2.提取的樣品避免反復(fù)凍融,否則影響RNA提取得率和質(zhì)量。
3.本品中含有苯酚,具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內(nèi)、接觸皮膚、吞食等會導(dǎo)致中
毒、灼傷以及其他身體傷害。使用本制品時應(yīng)穿戴防護(hù)物品,如防護(hù)服裝、手套、
眼罩、面罩等。如果不小心接觸到眼睛,應(yīng)立即用大量的水沖洗并前往醫(yī)院治療。
4.樣品用TRIzon 勻漿后,如不即刻加入氯仿,置于-70℃下可放置一個月以上。
5.保存在75%乙醇中的RNA沉淀,2-8℃可以保存一周,-20℃條件下可以保存1年。
RNA半衰期比較短,容易降解,建議提取后盡快進(jìn)行后續(xù)實驗,如反轉(zhuǎn)錄成cDNA,
Northern Blot等。
6.若下游實驗對DNA非常敏感,建議用不含RNase的DNase I(貨號:YJ2090A)對
RNA進(jìn)行處理。
自備試劑:氯仿、異丙醇、75%乙醇、無RNase的水(新開封或提取RNA專用)。
操作步驟
1.各種材料的處理
1a.植物組織:取新鮮植物組織在液氮中充分研磨或?qū)⒅参锝M織剪碎后直接在TRIzon
中迅速研磨,每30-50 mg組織加入1 ml TRIzon,混勻。
注意:樣品體積一般不要超過TRIzon體積的10%。
1b.動物組織:取新鮮或-70℃凍存的動物組織盡量剪碎,每30-50 mg組織加入1 ml
TRIzon,勻漿儀進(jìn)行勻漿處理?;蛟谝旱醒心ズ蠹尤?/span>TRIzon 1 ml混勻。
注意:樣品體積一般不要超過TRIzon體積的10%。
1c.單層培養(yǎng)細(xì)胞:吸去培養(yǎng)液,可直接在培養(yǎng)板中加入適量TRIzon(每10 cm2面積
需要1 ml TRIzon),用取樣器反復(fù)吹打使細(xì)胞裂解。也可用胰蛋白酶處理后,將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至RNase-Free的離心管中,300×g離心5 min,收集細(xì)胞沉淀,仔細(xì)吸除所有上清,加入TRIzon 1 ml混勻。
注意:1)收集細(xì)胞數(shù)量不要超過1×107。
2)TRNzol加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定,不是由細(xì)胞數(shù)決定。如果TRIzon加量不足,可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染。
3)收集細(xì)胞時一定要將細(xì)胞培養(yǎng)液去除干凈,否則會導(dǎo)致裂解不*,造成RNA的產(chǎn)量降低。
1d.細(xì)胞懸液:離心收集細(xì)胞。每5×106 -1×107動物、植物和酵母細(xì)胞或每107細(xì)菌
注意:細(xì)胞加入1)加入1 mlTRIzon TRIzon前不要洗。 滌細(xì)胞,以免RNA降解。
2)一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞可能需要勻漿儀或液氮研磨處理。
1e.血液處理:直接取新鮮的血液,加入3倍體積TRIzon(推薦0.25 ml全血加入0.75 ml
TRIzon),充分振蕩混勻。
1f.可選步驟:對于蛋白、脂肪、多糖或胞外物質(zhì)含量高的樣品,如肌肉組織、脂肪組
織或植物的塊莖,可以在勻漿處理后4℃,12,000 rpm(~13,400×g)離心10分鐘以除去不溶物質(zhì),此時沉淀中含胞外物質(zhì)、多糖和高分子量的DNA,而RNA存在于上清中。
2.樣品中加入TRIzon后反復(fù)吹打幾次,使樣本充分裂解。室溫放置 5分鐘,使蛋白核
酸復(fù)合物*分離。
3.向以上溶液中加入氯仿,每使用1 ml TRIzon加入0.2 ml氯仿,蓋好管蓋,劇烈振蕩
15秒,室溫放置2-3分鐘。
4.4℃ 12,000 rpm離心15分鐘,此時樣品分成三層:紅色有機(jī)相,中間層和上層無色
水相,RNA 主要在水相中,把水相(約600 μl)轉(zhuǎn)移到一個新的RNase-Free離心管
(自備)中。
5.在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇,顛倒混勻,室溫放置10分鐘。
6.4℃ 12,000 rpm離心10分鐘,棄上清。
7.加入75%乙醇(用無RNase的水配制)洗滌沉淀。每使用1 ml TRIzon用1 ml 75%乙醇對沉淀進(jìn)行洗滌。
8.4℃ 12,000 rpm離心3分鐘,小心吸棄上清,注意不要吸棄RNA沉淀。
注意:剩余的少量液體可短暫離心,然后用槍頭吸出,注意不要吸棄沉淀。
9.室溫放置2-3分鐘,晾干。加入30-100 μl無RNase的水,充分溶解RNA,得到的RNA 保存在-70℃,防止降解。
注意:沉淀不要過分干燥,以免難于溶解。
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