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環(huán)丙沙星快速檢測試劑盒說明書
一、原理
試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物環(huán)丙沙星藥物和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗環(huán)丙沙星藥物抗體,加入酶標記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留環(huán)丙沙星藥物的含量成負相關,與標準曲線比較即可得出相應殘留物環(huán)丙沙星藥物的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度: 1ppb
u 孵育溫度: 25℃
u 孵育時間: 30min~15min
u 樣本檢測下限
環(huán)丙沙星(CIF) 檢測下限 ··················· 1ppb
u 交叉反應率
環(huán)丙沙星(CIF) ···························· 92.88%
u 樣本回收率
組 織\雞蛋 ································· 80±15%
血 清 ······································ 80±15%
蜂 蜜 ······································ 75±15%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條8孔,一板12條 | |
2 | 標準液×6瓶 (1ml/瓶) | 0ppb | 1ppb |
3ppb | 9ppb | ||
27ppb | 81ppb | ||
3 | 酶標記物 | 7ml | 紅色帽 |
4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 2X濃縮復溶液 | 50ml | 透明帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器:微孔酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平(感量0.01g)
微量移液器:單道 20~200ul、單道100~1000ul、多道 250 ul
試 劑:濃鹽酸、二氯甲烷、正己烷、乙腈、肝素鈉、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
處理任何樣本時,都必須注意:
(a) 本試劑盒所檢測的組織樣本包括:動物組織、禽類和水產組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。
(b) 實驗中必須使用一次性吸頭,在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
(c) 實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,必要時可對實驗器具進行清潔,以避免污染干擾實驗結果。
u 樣本前處理需配制:
配液1 0.1M HCL溶液:
860µl濃鹽酸加去離子水100ml溶解。
配液2 乙腈-二氯甲烷混合溶液:
V乙腈:V二氯甲烷 = 1 : 4
配液3 pH7.2 0.02M PB緩沖液:
5.16g Na2HPO4·12H2O + 0.87g NaH2PO4·2H2O
加去離子水1L溶解。
配液4 乙腈-二氯甲烷-0.1MHCl混合溶液
100ml乙腈-二氯甲烷(V乙腈:V二氯甲烷 = 4 :1) 混合溶液中加入5ml 0.1M HCl溶液。
配液5 用去離子水將2X濃縮復溶液按1:1稀釋
(1份濃縮復溶液+1份去離子水)用于樣本復溶。
(a)組織樣本(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等),雞蛋樣本處理方法
1、稱2.0±0.05g 均質過的組織樣本于50ml離心管中;
2、加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml,振蕩5min,4000r/min以上,15℃離心10min;
3、取4ml有機相至干燥容器中,56℃氮氣吹干/旋轉蒸發(fā)至干;
4、用1ml稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物,加入正己烷1ml混合30s,4000r/min以上,15℃離心5min;
5、去除上層取下層50µl液體用于分析。
樣本稀釋倍數:1
(b)血清樣本的處理
1、用加有肝素鈉(20-30單位/ml血)的離心管采集雞血樣本(建議采血注射器也用肝素鈉潤洗),血樣本室溫靜置1h,待析出血漿后4000r/min以上,15℃離心10min,取出血漿1ml;
2、加入乙腈(無水)4ml上下充分混合5min,4000r/min以上,15℃離心10min;
3、移上清至另一離心管中,加入2ml 0.02M PB緩沖液,混勻;
4、加入二氯甲烷5ml,充分混勻5min,4000r/min,15℃離心10min,去上層,取下層有機相到干燥瓶中(清亮無雜質),50℃旋轉蒸發(fā)至干/氮氣吹干;
5、用1ml稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物,加入正己烷1ml混合30s,4000r/min以上,15℃離心5min;
6、輕吸掉上層和中間白色雜質,取下層相100µl加入100µl稀釋后的復溶液,混合30s;
7、取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數:2
(c)蜂蜜樣本處理方法:
1、 取2.0±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中;加入8ml乙腈-二氯甲烷-0.1MHCl混合溶液, 充分振蕩3min,15℃ 4000r/min以上離心10min;
2、 取2ml上清液于56℃氮氣或空氣流吹干;
3、 加入1ml的樣本復溶液,充分震蕩1min;
4、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數: 2倍
六、 酶標免疫分析程序:
u 測定前應須知:
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(20-25℃)。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、 在ELISA分析中的再現性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟:
5、 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出,置室溫(20-25℃)平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
6、 按需要取出微孔條及板架,將不用的微孔板重新密封,保存于2-8℃,不要冷凍。
7、 配液:將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液。
8、 編號:將樣本和標準品對應微孔按序編號,每個樣本和標準品均需做2孔平行,并記錄標準孔的樣本孔所在的位置。
9、 加標準品/樣本50µl /孔,然后加酶標記物50μl/孔,再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板,25℃環(huán)境反應30min。
10、 用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次,每次浸泡15-30秒,拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
11、 顯色:每孔加入底物A液50µl再加入底物B液50µl,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境避光顯色15min。
12、 測定:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,設定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,在5min內讀完數據),測定吸光度值(OD值)。
七、結果判定
結果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含環(huán)丙沙星藥物量成負相關。
1、粗略判定:
用樣本的平均吸光度值與標準品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.238, 樣本2的吸光度值為0.946,標準液吸光度值分別是:0ppb為1.845; 1ppb為1.542;3ppb為1.130; 9ppb為0.635;27ppb為0.326; 81ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是27ppb - 81ppb;樣本2的濃度范圍是3ppb - 9ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中環(huán)丙沙星藥物的實際濃度。
2、定量分析
(1)百分吸光率的計算,標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光率(%)= | B | ×100% |
B0 |
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
(2)標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標,以環(huán)丙沙星標準品濃度(ng/ml)的半對數為橫坐標,繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中環(huán)丙沙星藥物實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算,更便于大量樣本的準確、快速分析。(歡迎來電索?。?/span>
八、 注意事項
1、 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫(20-25℃)會導致所有標準的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況,則會伴隨著標準曲線不成線性,重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻,否則會出現重復性不好的現象。
4、 反應終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封;標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質,應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時,表示試劑可能變質。
8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃,溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質期
1、 儲藏條件:試劑盒于2-8℃保存,不要冷凍。
2、 保 質 期:該產品有效期為1年,生產日期見包裝盒。
提示:酶標板真空包裝袋若有漏氣,酶標板仍然正常有效,不影響實驗結果,請放心使用。
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