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替米考星快速檢測雞肉豬肉
更新時間:2022-08-26 點擊量:1151

EF54A\H1

替米考星

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物替米考星將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭替米考星抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物替米考星的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物替米考星的含量。

二、試劑盒特性

試劑盒靈敏度:   0.5ppb

孵育溫度:       25℃

孵育時間:       20min10min

樣本檢測下限

雞肉、豬肉 ·········································  2ppb

交叉反應(yīng)率

替米考星 ··········································  100%

樣本回收率

雞肉、豬肉 ······································· 90±30%

三、試劑盒組成

1

微量測試孔

每條8孔,一板12

2

標(biāo)準(zhǔn)×6

1ml/瓶)

0ppb

0.5ppb

1.5ppb

4.5ppb

13.5ppb

40.5ppb

3

酶標(biāo)記物

7ml

紅色帽

4

抗體工作液

7ml

藍(lán)色帽

5

底物A

7ml

白色帽

6

底物B

7ml

黑色帽

7

終止液

7ml

黃色帽

8

20X濃縮洗滌液

15ml

白色帽

9

5X樣本提取液

50ml×2

透明帽

四、所用儀器、試劑

具備的儀器:酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)、恒溫箱、打印機(jī)

微量移液器:單道 20200µl、單道1001000µl、多道 30300 µl

需要的試劑:濃鹽酸、氫氧化鈉

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

a)實驗中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時要更換吸頭。

b)實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔,以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理需配制:

配液1  0.2M 鹽酸

       17.2ml濃鹽酸加去離子水定容至1L

配液2  1M 氫氧化鈉

       4g氫氧化鈉固體加去離子水定容至

       100ml。

配液3  樣本提取

       去離子水5X樣本提取液41比例混

       合均勻

樣本處理:

a 雞肉、豬肉樣本處理方法: 

1、取2.0±0.05g粉碎后的樣本于50ml離心管中;

   加入3ml 0.2M鹽酸(見配液1),充分振蕩3min

2、加入600ul 1M 氫氧化鈉 (見配液2)溶液和

   2.4ml 樣本提取液(見配液3,充分振蕩3min,

   20℃ 4000r/min以上離心10min;

3、50µl上層液進(jìn)行分析(注:離心后若有脂肪

   層,先去除脂肪層或撥開脂肪層取清澈液體進(jìn)行

   分析)。

   樣本稀釋倍數(shù):4     

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

測定前應(yīng)須知:

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(2025℃)。

2、 使用之后立即將所有試劑放回28℃。

3、 ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜

    蓋住微孔板。

操作步驟:

1、 28℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(2025)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放入自封袋,保存于28℃。

3、 配液:將15ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照119稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜蓋板,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境反應(yīng)20min。

6、 將孔內(nèi)液體甩干,用稀釋后的洗滌液250µl/孔洗板45次,每次間隔1530秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

7、 顯色:加入底物A50µl/孔,再加入底物B50µl/孔,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境中避光顯色10min。

8、 測定:加入終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,5min內(nèi)讀數(shù)),測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含替米考星量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定:

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.2,樣本2的吸光度值為1.0,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb2.005; 0.5ppb1.6431.5ppb1.19;4.5ppb0.67;13.5ppb0.26;40.5ppb0.13。則樣本1的濃度范圍是13.5ppb40.5ppb;樣本2的濃度范圍是1.5ppb4.5ppb,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中替米考星實際濃度。

2、定量分析

1)百分吸光率的計算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即

百分吸光率(%)=

B

×100%

B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以替米考星標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中替米考星實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來電索取)

八、 注意事項

1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫(2025℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻,否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時,表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1、 儲藏條件:試劑盒于28℃保存,不要冷凍。

2、  質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示:酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,酶標(biāo)板仍然正常有效,不影響實驗結(jié)果,請放心使用。

 

 

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