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021-65232515
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苯乙醇胺A
快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物苯乙醇胺A將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗苯乙醇胺A抗體,加入酶標記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物苯乙醇胺A的含量成負相關(guān),與標準曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物苯乙醇胺A的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度: 0.1ppb
u 孵育溫度: 25℃
u 孵育時間: 30min~15min
u 樣本檢測下限
尿 樣 ····························· 0.1ppb
組 織 ····························· 0.2ppb
飼 料 ····························· 0.5ppb
u 交叉反應(yīng)率
苯乙醇胺A ······································ 100%
克倫特羅(Clenbuterol) ························ <1%
沙丁胺醇(Salbutamol ) ····················· <1%
萊克多巴胺(Ractopamine)··················· <1%
u 樣本回收率
尿 樣 ······························ 95%±25%
組織、飼料 ······························ 85%±25%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條8孔,一板12條 | |
2 | 標準液×6瓶 (1ml/瓶) | 0ppb | 0.1ppb |
0.3ppb | 0.9ppb | ||
2.7ppb | 8.1ppb | ||
3 | 酶標記物 | 7ml | 紅色帽 |
4 | 抗體工作液 | 10ml | 藍色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 2X濃縮復(fù)溶液 | 50ml | 透明帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器:酶標儀、打印機
微量移液器:單道 20~200µl、單道100~1000µl、多道 30~300 µl
使用的試劑:乙酸乙酯、冰乙酸、正己烷
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
(a)實驗中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時要更換吸頭。
(b)實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,必要時可對實驗器具進行清潔,以避免污染干擾實驗結(jié)果。
u 樣本前處理需配置
配液1 樣本提取液:
取99ml乙酸乙酯,加入1ml冰乙酸,混合均勻。
配液2 樣本復(fù)溶液:
將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1:2稀釋。
u 樣本處理:
(a)尿樣本處理方法
取20µl清亮尿樣直接測定(如果尿樣渾濁一定要過濾或4000r/min離心10min,直至得到清亮尿樣),暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。
樣本稀釋倍數(shù): 1倍
因樣本存在一定干擾,建議以1ppb為樣本陽性 的CUT OFF值。
(b)組織樣本處理方法
1、 稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g到50ml離心管中;
2、 加入8ml樣本提取液,渦旋震蕩2min;
3、 室溫4000r/min離心10min;
4、 取上層清液2ml于50-60℃吹干;
5、 加入1ml正己烷,再加入1ml樣本復(fù)溶液,渦旋震蕩30秒;
6、 室溫4000r/min離心10min;除去上層有機相;
7、 取下層清液20µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 2倍
因樣本存在一定干擾,建議以1ppb為樣本陽性的CUT OFF值。
(c)飼料樣本處理方法
1、 稱取均質(zhì)后的飼料樣本1±0.05g到50ml離心管中;
2、 加入10ml樣本提取液,渦旋震蕩3min;
3、 室溫4000r/min離心10min;
4、 取上層清液2ml于50-60℃吹干;
5、 加入1ml正己烷,再加入1ml樣本復(fù)溶液,渦旋震蕩30秒;
6、 室溫4000r/min離心10min;除去上層有機相;
7、 取下層清液20µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 5倍
因樣本存在一定干擾,建議以2ppb為樣本陽性的CUT OFF值。本試劑盒檢測牛尿時回收率偏高。
六、 酶標免疫分析程序:
u 測定前應(yīng)須知:
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(20~25℃)。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2~8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟:
1、 從2~8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(20~25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 配液:將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液。
3、 取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放入自封袋,保存于2~8℃。
4、 編號:將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標準品做2孔平行,并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標準品/樣本20µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標記物50µl/孔,再加入80µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜蓋板,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境反應(yīng)30min。
6、 將孔內(nèi)液體甩干,用稀釋好的洗滌液250µl/孔洗板4~5次,每次間隔15~30秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
7、 顯色:加入底物A液50µl/孔,再加入底物B液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境中避光顯色15min。
8、 測定:加入終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,5min內(nèi)讀數(shù)),測定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含苯乙醇胺A量成負相關(guān)。
1、粗略判定:
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,樣本2的吸光度值為1.0,標準液吸光度值分別是:0ppb為2.143; 0.1ppb為1.866;0.3ppb為1.615;0.9ppb為0.964;2.7ppb為0.413;8.1ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.3ppb~0.9ppb;樣本2的濃度范圍是2.7ppb~8.1ppb,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中苯乙醇胺A實際濃度。
2、定量分析
(1)百分吸光率的計算,標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光率(%)= | B | ×100% |
B0 |
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
(2)標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標,以苯乙醇胺A標準品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標,繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中苯乙醇胺A實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算,更便于大量樣本的準確、快速分析。(歡迎來電索?。?/span>
八、 注意事項
1、 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫(20~25℃)會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標準曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻,否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封;標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時,表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、 儲藏條件:試劑盒于2-8℃保存,不要冷凍。
2、 保 質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示:酶標板真空包裝袋若有漏氣,酶標板仍然正常有效,不影響實驗結(jié)果,請放心使用。
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