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ELISA檢測的干擾因素與方法
更新時間:2011-12-06 點擊量:1639

ELISA檢測的干擾因素與方法

 

ELISA應(yīng)用zui廣,但這種固相測定技術(shù)非無缺,把握實驗過程中每一個可能出現(xiàn)差錯的關(guān)鍵性問題,采取相應(yīng)的舉措,才有可能使實驗性誤(漏)診減少到zui低限度。

 1. 表面效應(yīng)

首先必須明確指出的是,:“固相”ELISA與傳統(tǒng)的“液相”血清學(xué)試驗的zui大.zui本質(zhì)的區(qū)別是有一個預(yù)先固相抗原或抗體到載體表面的步驟,以及抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)由液態(tài)環(huán)境移

到了固相載體表面進(jìn)行。蛋白質(zhì)分子在吸附過程中,為了克服與固相載體之間的排斥力,需要重新分布其表面的功能性基因,使疏水性基因充分暴露,然后,局部接觸區(qū)域的偶極分子脫氫,再通過范德瓦爾斯力吸引而固相到載體表面。                                                      表面效應(yīng)可直接影響抗原,抗體的構(gòu)象和功能。此外,表面效應(yīng)亦影響抗原和抗體結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)過程。

(1)    固相導(dǎo)致抗原的變化  為了測定抗體水平,需預(yù)先將抗原固相(包被)到極性和

水性的聚苯乙烯(PS)或聚氯乙烯(PVC)酶標(biāo)板上。用直接物理吸附方法固相蛋白抗原及DNA等,導(dǎo)致的變化是多方面的,可引起分子構(gòu)象和抗原性發(fā)生改變。酶活性測定時可消失。牛血清白蛋白固相之后,其抗原價可由5價降為1價。此外,發(fā)現(xiàn)被動吸附方法固相鐵蛋白,呈團(tuán)串狀,不均一的 隨機(jī)分布,這種影響質(zhì)控的情況具有普遍性。zui后,大多數(shù)小分子半抗原不易直接吸附到載體表面。解決這一難題的方法,一般是采用在小分子 抗原上,先偶聯(lián)上葡聚糖,明膠等手臂后再進(jìn)行固相包被。對于有多重表達(dá)抗原決定簇的大分子抗原,用抗體橋式包被法可避免表面效應(yīng)的影響。將蛋白抗原吸附于膠體AI(OH)3后再固相也可以避免蛋白變性。用Y射線輻照(400GYPS板,不但可增加蛋白抗原吸附能力,而且還有降低抗體測定本底的作用。

(2)    固相對抗體的影響   直接吸附固相抗體(Igs)分子,除了呈團(tuán)串狀,不均分布和易解吸等一般不利因素之外,Igs分子攤開在載體表面,不但構(gòu)象發(fā)生改變,而且影響抗體的活性,如IgG的結(jié)合價減少,可由2價變?yōu)?span lang="EN-US">1價,甚至*失活。實驗結(jié)果表明,單克隆抗體比多克隆抗體更易失活,固相后仍能保持結(jié)合能力的分子僅占少數(shù),分別為3%5%-10%。這不但浪費(fèi)抗體試劑,更可惜的是空置了有限的微孔表面積??贵w分子N末端為FabC末端為Fc,直接被動吸附的隨意性,造成一部分Fab,C末端為Fc,直接被動吸附的隨意性,造成一部分Fab結(jié)合位點朝向載體一面,或因用量過多而造成的重疊吸附,部分Fab結(jié)合位被遮蓋,均可導(dǎo)致其總體結(jié)合能力下降。為此,出現(xiàn)了可以“錨定”F.段在載體表面,而使Fab朝外的共價結(jié)合法,即在載體上導(dǎo)入氨基 肼基等活性基因,然后在水溶性碳二胺作用下,與Igs的羧基共價結(jié)合,或直接與羥基化糖基產(chǎn)生的醛基共價結(jié)合:含溴乙烯基團(tuán)的PS板,可在雙功能交聯(lián)劑如戊二醛的幫助下與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。目前,國外已有有關(guān)的酶標(biāo)板產(chǎn)品()供應(yīng)。

橋式法是一種避免Igs與載體直接接觸的固相方法,有幾種不同的類型:(1)抗抗體法:(2SPA法:(3)鏈酶親和素生物素法,這一種方法應(yīng)用 zui為成功,只要預(yù)先將*捕捉抗體生物素化:(4)抗半抗原抗體法,這需要將捕捉體預(yù)先記半抗原。

   3)抗體介導(dǎo)的抗原分子變構(gòu)  抗原與抗體分子在三維立體空間自由運(yùn)動,互相碰撞,彼此特異性結(jié)合,這種結(jié)合不似早期相像中的單純的“鎖-匙”關(guān)系,而是一種柔性的誘導(dǎo)契合??乖肿記Q定簇可以突入到Fab的深底部,反過來,Fab為了執(zhí)行其固有生物學(xué)功能,主動地發(fā)生變角折彎,錐形轉(zhuǎn)動及zuiN末端可變區(qū)的“球穴”擺動,以契合抗原決定簇,Fab亦可突入到大分子抗原的較深的位區(qū)。液態(tài)中的抗原體分子在完成一級結(jié)合反應(yīng)之后,該復(fù)合物可以通過抗原抗體之間的特異性結(jié)合,亦可通過抗體Fc-Fc段的非特異性結(jié)合而進(jìn)一步交聯(lián),形成肉眼可見的晶格形網(wǎng)絡(luò)沉淀凝集型的抗原抗體二級反應(yīng)復(fù)合物。縱觀全過程,抗原分子一般總能保持其固有的構(gòu)象,而復(fù)合物中的抗體構(gòu)象變化則較大。相反,在固相抗體測定抗原的過程中,由于表面效應(yīng)的關(guān)系,抗體介導(dǎo)的抗原分子變構(gòu)具有特殊意義。

2. HD-HOOK效應(yīng)

這種發(fā)生在固相法試驗過程中的可造成“假低值”甚至“假陰性”錯誤結(jié)果的特殊效應(yīng),稱為“高劑量鉤鐮(HD-HOOK)效應(yīng)”。它的產(chǎn)生條件、分子基礎(chǔ)、導(dǎo)致的后果等,都與傳統(tǒng)的液相沉淀、凝集反應(yīng)中的“區(qū)帶現(xiàn)象”不一樣。在一步二位點夾心ELISA中,主要是因為待測抗原的總量過高,競爭結(jié)合反應(yīng)系統(tǒng)中的*標(biāo)記二抗,從而產(chǎn)生抗原越多,zui終反應(yīng)信號越低的HD-HOOK效應(yīng),如HBsAg等可出現(xiàn)假陰性??乖?ldquo;量”是決定的因素,一般認(rèn)為二步二位點夾心固相測定法不會產(chǎn)生抗原過剩的“陰滯現(xiàn)象之觀點,早已被Miles的實踐否定,只是并非所有二步夾心法都會產(chǎn)生HD-HOOK效應(yīng)。迄今為止,僅少數(shù)具有多重抗原決定簇的大分子蛋白質(zhì)抗原,如鐵蛋白、前列腺特異抗原(PSA)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(Afp)、細(xì)胞溶素-D等,本身具有分子變構(gòu)內(nèi)因的抗原,測定時發(fā)現(xiàn)了HD-HOOK效應(yīng)??乖?ldquo;質(zhì)”的特性是決定的因素,而標(biāo)記二抗介導(dǎo)抗原分子變構(gòu)是重要的外因。當(dāng)然抗原的數(shù)量亦是*的相關(guān)因素。以鐵蛋白為例,被捕捉的鐵蛋白抗原分子,與親和性比一抗大的標(biāo)記二抗發(fā)生交叉重疊結(jié)合后,由于立體效應(yīng),可促使鐵蛋白分子變構(gòu),使其與一抗解離,形成標(biāo)記二抗與鐵蛋白分子復(fù)合物,而被隨后的洗滌過程洗離出去,zui終的信號下降。在劑量反應(yīng)曲線的高劑量(HD)區(qū)段,其線型走向不是呈平臺狀無限后延,而呈向下彎落狀,似一只鉤或一把鐮刀(HOOK).若單純從劑量反應(yīng)曲線的鉤狀圖形來看,與區(qū)帶現(xiàn)象中抗原過剩型復(fù)合物的“后帶現(xiàn)象”十分相似。然而,其分子基礎(chǔ)*不同,“晶格理論”僅能解釋區(qū)帶現(xiàn)象,而對固相二步夾心ELISAHD-HOOK效應(yīng)的解釋,目前認(rèn)為,“抗原分子變構(gòu)理論”比較貼切。

     克服HD-HOOK效應(yīng),主要依靠試劑盒的生產(chǎn)廠家。首先,對靶抗原的決定簇應(yīng)盡可能弄清楚,在此基礎(chǔ)上,選擇僅有一種而且僅有兩個重復(fù)表達(dá)的決定簇,或者兩種且每種僅有一個表達(dá)的決定簇,選用相應(yīng)的一個單抗,或者兩個相應(yīng)單抗來組建藥盒,有可能從根本上解決HD-HOOK效應(yīng)的弊端。作為應(yīng)用者,可用稀釋測定法解決這一問題。                                       在測定未知標(biāo)本的aFP值時候,用原標(biāo)本與10倍稀釋的標(biāo)本同時測定,發(fā)現(xiàn)原倍孔A值低于稀釋孔,證實了HD-HOOK的存在,從而避免了實驗的誤(漏)診。

                                           http:/www.fxbiocc.com

 

滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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