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禽流感病毒H5/H7/H9型(H5/H7/H9)三重核酸檢測(cè)試劑盒 (熒光RT-PCR法)
更新時(shí)間:2024-08-16 點(diǎn)擊量:251

流感病毒H5/H7/H9型H5/H7/H9三重核酸檢測(cè)試劑盒

(熒光RT-PCR法)

 

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:流感病毒H5/H7/H9H5/H7/H9)三重核酸檢測(cè)試劑盒(熒光RT-PCR法)

 

【包裝規(guī)格】50T/盒

 

【預(yù)期用途】

禽流感病毒(AIV)屬甲型流感病毒。流感病毒屬于RNA病毒的正黏病毒科,分甲、乙、丙3個(gè)型。其中甲型流感病毒多發(fā)于禽類,一些甲型也可感染豬、馬、海豹和鯨等各種哺乳動(dòng)物及人類;乙型和丙型流感病毒則分別見于海豹和豬的感染。甲型流感病毒是依據(jù)病毒表面的血細(xì)胞凝集素H)和神經(jīng)氨酸酶N)來命名,其中H有16個(gè)亞型,N有9個(gè)亞型。本試劑盒適用于檢測(cè)標(biāo)本中的流感病毒H5、H7和H9亞型病毒RNA,適用于流感病毒H5、H7和H9亞型感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查

 

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒用流感病毒H5、H7和H9亞型的特異性基因分別設(shè)計(jì)2特異性引物,分別結(jié)合1條特異性熒光探針,用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對(duì)流感病毒H5、H7和H9亞型的RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

 

【試劑組成】

     

規(guī)      

H5/H7/H9酶液

50μL×1管

H5/H7/H9反應(yīng)液

950ul×1管

H5/H7/H9陽性質(zhì)控品

50μL ×1管

陰性質(zhì)控品

50μL ×1管

說明:不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融不超過5次,有效期12個(gè)月。

 

適用儀器

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus、安捷倫MX3000P/3005P、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量PCR檢測(cè)儀。

 

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽,取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織;待檢活禽,采集1ml血液樣本置于1.5ml滅菌離心管中,或用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物,置于1mL 50%甘油生理鹽水中。

 

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過6個(gè)月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

 

使用方法

1. 樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1 樣本前處理

每份組織分別從3個(gè)不同的位置稱取樣品約1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中;棉拭子直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中;血液待血凝后取血清100μL于1.5mL滅菌離心管中。

 

1.2 RNA提取

為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠,建議使用商品化的RNA 提取試劑盒進(jìn)行提取,嚴(yán)格按照對(duì)應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

 

2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

 

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照;樣品每滿7份,多配制1份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑

H5/H7/H9反應(yīng)液

酶液

用量

19μL

1μL

 

3. 加樣(樣本處理區(qū))

將步驟1提取的RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

 

4. PCR擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為25μL;

熒光通道選擇: 檢測(cè)通道(Reporter Dye)FAM檢測(cè)禽流感病毒H5亞型、HEX/VIC檢測(cè)禽流感病毒H7亞型,CY5通道檢測(cè)禽流感病毒H9亞型,淬滅通道(Quencher Dye)選擇NONE,請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時(shí)間

收集熒光信號(hào)

1

1cycle

50

15min

2

1 cycle

95℃

3min

3

45cycle

95

15sec

55℃

30sec

 

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline和Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold的Value值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。

 

5.2 結(jié)果判斷

陽性:檢測(cè)通道Ct值≤38.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑檢測(cè)通道38.0<Ct值<40.0,且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn),重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)Ct值<40.0且有典型擴(kuò)增曲線者為陽性,否則為陰性。

陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果無Ct值且無明顯的擴(kuò)增曲線。

 

6. 檢測(cè)方法的局限性

樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

陽性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果;

病原體在流行過程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;

本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

 

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:無明顯擴(kuò)增曲線且無Ct值顯示;

陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期,且Ct值≤30

以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

 

8. 性能指標(biāo)

1)敏感性:內(nèi)控樣本敏感性為100%,綜合評(píng)價(jià)敏感性98%以上。最低檢測(cè)限不低于1000copies/ml。

2)特異性:100%。

3)穩(wěn)定性:批內(nèi)及批間差異≤3%。

 

注意事項(xiàng)

所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;

試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完全混勻并短暫離心;

反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

實(shí)驗(yàn)完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;

試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

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