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021-65232515
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一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中， 特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號(hào)傳遞的作用，是一
種新型的生物信使分子，在機(jī)體的生理、病理過(guò)程中起著重要的作用。
測(cè)定原理：
NO 在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成 NO2— ，在酸性條件下，NO2— 與重氮鹽磺酸胺生成重氮 化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在 550nm 處有特征吸收峰，測(cè)定其吸光值， 可以計(jì)算 NO 含量。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、研缽或勻漿器、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。 試劑組成和配制：
提取液：液體 100mL× 1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 6mL× 1 瓶，4℃避光保存。（用之前震蕩溶解后使用）
試劑二：液體 6mL× 1 瓶，4℃避光保存。(用之前 60℃加熱震蕩 15min)
樣品處理：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~ 10 的比例（建議稱(chēng)取約 0. 1g 組織，
加入 1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心 15min ，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建 議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w ，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g ，4℃ , 離心 15min ，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測(cè)定。
測(cè)定步驟和操作表：
1 、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 550nm。
2 、操作表
空白管 | 測(cè)定管 | |
樣品(μL） | 100 | |
提取液(μL） | 100 | |
試劑一 (μL） | 50 | 50 |
試劑二(μL） | 50 | 50 |
混勻，室溫靜置 15min ，于微量石英比色皿/96 孔板，測(cè)定 A550 ， ΔA=A 測(cè)定-A 空白 | ||
NO 含量計(jì)算：
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.016x -0.0103 ，R2= 0. 9986
1 、組織樣品：
（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算
NO 含量(μmoL/g 鮮重）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W） × 10-3 = 0.125× ( ΔA +0.0103）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算
NO 含量(μmoL/mg prot）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣×Cpr） × 10-3 = 0.125× ( ΔA +0.0103）÷Cpr
2 、細(xì)胞：
NO 含量( μmol/104 cell）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量）× 10-3 = 0.125× ( ΔA +0.0103）÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）
3 、其他樣品：
NO 含量(μmoL/L）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷V 樣
= 125× ( ΔA +0.0103）
V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積，
1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.008x - 0.0103 ，R2= 0. 9986
1 、組織樣品：
（1）按樣本重量計(jì)算
NO 含量(μmoL/g 鮮重）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W） × 10-3 = 0.25× ( ΔA +0.0103）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算
NO 含量(μmoL/mg prot）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣×Cpr） × 10-3 = 0.25× ( ΔA +0.0103）÷ Cpr
2 、細(xì)胞：
NO 含量( μmol/104 cell）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量）× 10-3 = 0.25× ( ΔA +0.0103）÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）
3 、 其他樣品：
NO 含量(μmoL/L）=( ΔA +0.0103）÷0.008× V 反總÷V 樣=250× ( ΔA +0.0103）
V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
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