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SuperRT逆轉錄酶（RNase H-）說明書

SuperRT Reverse Transcriptase

目錄號：YJ0740

保存條件：-20℃保存。

組分說明

              Cat. No.                YJ0740       YJ0740A

              Kit Size                   25           100

              SuperRT，200 U/μl          25 μl       100 μl

              5×RT Buffer              120 μl       500 μl

本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途  

產品簡介

　　SuperRT逆轉錄酶是一種利用大腸桿菌工程菌進行重組與表達的全新逆轉錄

酶。與Moloney鼠白血病病毒來源的M-MLV和鳥成髓細胞病毒來源的  AMV不同，該酶

不具有RNase H活性，能夠轉錄多種 RNA模板，可利用極低量的總RNA或mRNA

合成cDNA*鏈，起始樣本量可低至pg級，zui大限度將RNA逆轉錄成cDNA*鏈。

SuperRT逆轉錄酶與RNA親合能力強，能通讀GC含量高，二級結構復雜的RNA模板，獲

得高產量的cDNA。該酶耐熱性及穩(wěn)定性強，操作簡單快速，可以合成   100bp-12kb的

cDNA。適用于*鏈cDNA的合成、RT-PCR、RT-qPCR以及全長cDNA文庫的構建等。

活性定義

　　以Poly（A）為模板，oligo（dT）為引物，在  37℃條件下，10分鐘內催化摻入  1

nmol的dTTP所需酶量定義為一個活性單位(U)。

質量控制

　　200 U的本酶和1  μg的16 S，23 S  rRNA在37℃下反應1小時，RNA的電泳譜帶不

發(fā)生變化。

注意事項

1．在操作過程中應避免RNase污染，防止RNA降解或實驗中的交叉污染，建議在專門

   的區(qū)域進行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經

   常更換手套。

2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙

   酯）水溶液在37℃處理12小時，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃

   器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應使用 0.1%的DEPC

   處理后進行高壓滅菌。

3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經短暫離心

   后使用。所涉及的酶類使用后應盡快放回-20℃，避免反復凍融。

4．若起始RNA的量小于50  ng，建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提

   供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

使用方法

注意：1 ng-5 μg總RNA可建立20 μl反應體系，如果總RNA量大于5 μg，請按比例擴大反應體系。i逆轉錄操作步驟：

1．將RNA模板、引物、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT和RNase-Free Water溶解并

   置于冰上備用。

2．根據以下表格配制反應體系，總體積為20 μl。

試劑             20 μl反應體系             終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each                  4  μl         500 μM Each

Oligo-dT Primer，100 μM

或  Random Primers，50 μM               1  μl

或  Specific Primer ,10 μM

RNA Template                          X  μl          50 pg-5 μg

5×RT Buffer                           4  μl              1×

SuperRT，200 U/μl                      1  μl

 RNase-Free Water                  up to 20  μl

    注意：若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

4．42℃孵育30-50分鐘，85℃孵育5分鐘。反應結束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

5．逆轉錄產物可直接用于PCR反應和熒光定量PCR反應，或置于-20℃長期保存。

  ii  若逆轉錄效率低，或RNA模板二級結構復雜、GC含量高時，建議采用以下步驟：

1．將RNA模板、引物、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT和RNase-Free Water溶解并

   置于冰上備用。

2．根據以下表格配制反應體系，總體積為15 μl。

 試劑                 20 μl反應體系             終濃度

 dNTP Mix，2.5 mM Each                   4  μl         500 μM Each

 Oligo-dT Primer，100 μM

 或  Random Primers，50 μM                1  μl

 或  Specific Primer ,10 μM

 RNA Template                           X  μl          50 pg-5 μg

 RNase-Free Water                   up to 15  μl

     3．70℃孵育10分鐘，迅速冰浴2分鐘。

     4．短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

     5．繼續(xù)向以上反應液中加入以下試劑：

試劑                  20 μl反應體系                 終濃度

5×RT Buffer            4 μl                              1×

         注意：若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，

         如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

     6．輕輕吹打混勻，若反轉錄引物為Oligo-dT  Primer或Specific  Primer時，42℃孵育2分 

        鐘；若反轉錄引物為Random Primers，則25℃孵育10分鐘。

     7．加入1 μl SuperRT（200 U/μl），輕輕吸打混勻。42℃孵育50分鐘。

     8．85℃孵育5分鐘。反應結束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

     9．逆轉錄產物可直接用于PCR反應和熒光定量PCR反應，或置于-20℃長期保存。

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