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PKC活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

PKC活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

產(chǎn)品型號(hào):

所屬分類:酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

產(chǎn)品時(shí)間:2024-08-30

簡(jiǎn)要描述:[平臺(tái)項(xiàng)目開(kāi)展范圍]慢病毒,腺病毒,RNAI類, 分子生物實(shí)驗(yàn),病理實(shí)驗(yàn),免疫學(xué)實(shí)驗(yàn),細(xì)胞實(shí)驗(yàn),動(dòng)物實(shí)驗(yàn),蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn),芯片類實(shí)驗(yàn),并為廣大客戶朋友們提供課題設(shè)計(jì)指導(dǎo)、基金申請(qǐng)指導(dǎo)、SCI. 核心期刊等服務(wù)。

詳細(xì)說(shuō)明:

PKC活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

 

實(shí)驗(yàn)試劑:瓊脂糖(Promega公司,V3125) ;其他常備試劑購(gòu)自sigma公司; PKC活性檢測(cè)試劑盒

(Promega公司,V5330)

實(shí)驗(yàn)儀器:電泳儀(北京六一廠,112-0640) ;水平電泳槽(北京六一廠,122-3146) ;電熱恒溫培養(yǎng)箱(碧云天生物,EBI025) ;電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠,HH-8)

基本原理:分離PKC蛋白(磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白),利用試劑 盒組分將2種蛋白分離并加以區(qū)分,利用電泳瓊脂糖凝膠技術(shù)顯示2種不同的蛋白,利用分析軟件將顯示的不同蛋白定量并加以比較,以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值顯示PKC活性(PKC活化度)。

 

操作步驟:

1.用預(yù)冷的勻漿器把細(xì)胞勻漿。

2.在4°C,用14,000 xg離心裂解液5分鐘,保存上清。

3.用PKC抽提液預(yù)平衡1ml的DEAE纖維素柱,再把第2步中得到的上清過(guò)柱。用5m的PKC抽提液洗柱子,然后用5ml含有200mM NaCI的PKC抽提液洗脫含有PKC的組分。

4.用PKC稀釋液(PKC dilution buffer)將少量蛋白激酶C (Promtein Kinase C)稀釋到2 .5ug/ml.隨試劑盒所附的產(chǎn)品信息中標(biāo)有這個(gè)酶的初始濃度。

5.用探頭超聲波破碎儀超聲處理PKC Activator Solution 20-30秒,或直到溶液變溫暖。

6.對(duì)每一個(gè)樣品,按照下面所列順序在0.5ml小離心管中混合PepTag@ PKC 5x Buffer,PepTag@ C1Peptide,超聲過(guò)的PKC Activator 5X Solution,和水。在樣品加入之前,小離心管-直要放在冰上。陰性對(duì)照將用于對(duì)反應(yīng)進(jìn)行定量時(shí)確定其摩爾吸收值(說(shuō)明書(shū)第IV.部分) 。

 

標(biāo)準(zhǔn)PKC檢測(cè)

PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer           5ul

PepTag@ C1 Peptide (0.4ug/ul)            5ul

PKC Activator 5X Solution,超聲處理的      5ul

短肽保護(hù)液(非必須)                    1ul

樣品                                 9ul

去離子水使終體積為                   25ul

 

PKC陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)

PepTag⑧PKC Reaction 5X Buffer          5ul

PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul)           5ul

PKC Activator 5XSolution,超聲處理的      5ul

短肽保護(hù)液(非必須)                   1ul

Protein Kinase C (2.5ug/ml溶于PKC dilution bufer)     4ul

去離子水使終體積為                  25ul

 

PKC陰性對(duì)照檢測(cè)(不加PKC)

PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer         5ul

PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul)          5ul

PKC Activator 5XSolution,超聲處理的     5ul

短肽保護(hù)液(非必須)                  1ul

去離子水使終體積為               25ul

 

7.在0時(shí)間點(diǎn),把-支管子從冰上移到30°C水浴中孵育2分鐘。然后加入樣品或蛋白激酶C在30°C再孵育30分鐘。

8.把管子放進(jìn)開(kāi)水浴或95°C加熱塊10分鐘以終止反應(yīng)。在凝膠電泳前把樣品-直避光存放在4°C或-20°C。

9.把樣品上樣到膠上之前,往每個(gè)樣品中加進(jìn)1ul的80%甘油,以確保樣品保留在上樣孔中(說(shuō)明書(shū)第II.F部分)。

10.每孔點(diǎn)樣10ul,在0. 8%瓊脂糖凝膠上以100V電泳15分鐘分開(kāi)樣品,拍照。

 

檢測(cè)結(jié)果:

說(shuō)明:后面2組泳道“陽(yáng)性(PC)"和“陰性(NC)"為試劑盒自帶系統(tǒng)對(duì)照。

注:陽(yáng)性條帶以Gel pro4版凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析,測(cè)其IOD (integrated optical density)累積光密度參考值。按照百分比例計(jì)算PKC活性百分比

(以陽(yáng)性對(duì)照I0D值為100,其余各組的PKC+ p-PKC總和為100分配IOD數(shù)值)

 

 

 

收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:

歡迎咨詢?cè)斦?,我們?huì)根據(jù)您的方案及需求制定詳細(xì)的服務(wù)協(xié)議。

更多實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)請(qǐng)瀏覽網(wǎng)站其他內(nèi)容,或來(lái)電詳詢!

 

 

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

ELISA試劑盒免費(fèi)代檢測(cè)

CCK8檢測(cè)

基因組DNA提取

 

蛋白相互作用分析

Western Blot

免疫組化

熒光定量PCR

動(dòng)物模型服務(wù)

流式細(xì)胞檢測(cè)

ROS氧化分析

激光共聚焦

DNA甲基化實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞劃痕

鈣離子濃度檢測(cè)

掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

microRNA測(cè)序

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

探針合成

ATP/ADP檢測(cè)

石蠟/冰凍切片

定點(diǎn)突變

線粒體膜電位(MMP)檢測(cè)

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

藥理毒理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

 

免疫共沉淀

真核表達(dá)載體構(gòu)建

染色質(zhì)免疫沉淀CHIP

非標(biāo)定量(Label-free)實(shí)驗(yàn)



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